小身材大能量！神经祖细胞来源的外泌体竟可以调控神经发生

神经退行性疾病是由大脑和脊髓的神经元或其髓鞘的丧失所致的疾病状态，临床上主要包括阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、多发性硬化、帕金森病等。干细胞移植被认为是治疗这些疾病的很有前途的一种方法，但是成人大脑中神经干/祖细胞（NPCs）数量有限，限制了其在神经系统疾病中的应用。将体细胞直接转化为诱导神经干/祖细胞（iNPCs）这一方法为疾病治疗提供了丰富的类NPC细胞。

虽然干细胞移植的治疗效果很好，但是这些细胞移植是如何发挥作用的仍然存在争议。最近研究发现，移植细胞可能通过外泌体来实现治疗效果。外源细胞，如间充质干细胞，分泌的外泌体作为微环境中的重要成分，可以促进各种中枢神经系统疾病模型的神经可塑性和功能恢复。

2019年8月16日，同济大学和美国内布拉斯加大学医学中心联合在《Cell Communication and Signaling》杂志上发表了最新重要工作[1]，文中阐述了NPCs和iNPCs来源的外泌体（分别为EXOs和iEXOs）对神经元分化的影响，通过microarray分析发现miR-21a在EXOs和iEXOs中显著差异表达，且miR-21a作为神经胶质细胞生成的新型调节因子，可介导外泌体的神经发生潜能。

实验思路设计：

从细胞培养上清中分离和鉴定外泌体

（超离、透射电镜、纳米粒径、WB等）            

 观察不同外泌体对神经元分化的影响

  （外泌体标记、qPCR、免疫荧光等）                 

检测不同外泌体中miRNA差异，确定关键miRNA

（microarray、qPCR等）

miR-21a调控NPCs分化

（miR-21a过表达和干扰、qPCR等）

不同外泌体中miR-21a对神经元分化的影响

（qPCR、细胞共培养等）

1、EXOs和iEXOs显示出对神经元分化有不同的影响

基于超速离心的方法分离收集EXOs和iEXOs，再通过透射电镜（TEM）、NTA和WB分别对外泌体进行鉴定。随后，将EXOs和iEXOs分别在体外分化条件下与NPCs共培养7天（DIV）（Fig. 1a），用PBS做对照。NPCs对外泌体的摄取实验是将外泌体先用PKH26进行标记，再与NPCs共培养（Fig. 1b）。实验结果显示，与对照组相比，EXOs处理而不是iEXOs处理，能显著增加Tuj1⁺神经元细胞比例（Fig. 1c，d），但是GFAP⁺胶质细胞比例在EXOs和iEXOs处理组及对照组中没有明显差异。随后用神经元的细胞特异性蛋白标志物（β-tubulin和GFAP）的转录水平升高进一步验证了这一结果（Fig. 1e）。

Fig. 1 EXOs能促进神经元分化

综上所述，实验结果表明，EXOs而非iEXOs处理能促进神经元分化，并且EXOs和iEXOs对胶质细胞分化均无影响。

2、EXOs和iEXOs显示出不同的miRNA谱

为了了解EXOs和iEXOs对神经元分化影响差异的机制，作者用microarray检测了全部miRNA的表达水平（Fig. 2a）。在已知的565个小鼠miRNA中，有506个在EXOs或iEXOs中表达。通过分析发现，有34个miRNAs的表达水平在EXOs和iEXOs里有显著差异（Fig. 2b，c），其中与EXOs相比，iEXOs中有19个显著上调的和15个是显著下调的。再随机选择一部分miRNA进行qPCR分析，以验证miRNA microarray结果（Fig. 2d）。接下来作者测定了这34个miRNAs在iNPCs和NPCs中的表达水平（Fig. 2e）。19个上调miRNAs中有15个miRNAs和15个下调miRNAs中有10个miRNAs与在iEXO和EXOs之间观察到的趋势相似，这意味着外泌体的miRNA特征在很大程度上继承了供体细胞的miRNA特征。

Fig. 2 EXOs和iEXOs表现出不同的miRNA谱

3、miR-21a调控NPCs分化

有趣的是，筛选方法显示，与EXOs和NPCs相比，iEXOs和iNPCs中的miR-21a水平明显较低。qPCR结果显示，miR-21a水平在脑部发育和NPCs分化过程中随着时间增加而升高，这提示了其在调节神经发生中的作用。为了确定miR-21a是否介导iEXOs和EXOs对神经元分化的差异效应，作者分别使用miR-21a特异性抑制剂和mimics，通过功能缺失（LOF）和功能获得（GOF）方法检测miR-21a在NPCs分化中的作用。首先转染miR-21a抑制剂（=LOF组）或抑制剂对照到NPCs，在分化条件下培养7个DIV（Fig. 3a）。转染效率用qPCR验证，相比对照组，LOF组的miR-21a表达水平显著降低（Fig. 3b），同时LOF组β-tubulin和GFAP表达水平分别显著降低和升高。抑制miR-21a表达后，Tuj1⁺细胞比例显著降低，GFAP⁺细胞比例显著升高（Fig. 3c，d）。接下来，将miR-21a mimics（=GOF组）和对照组分别转染到NPCs，在分化条件下培养7个DIV（Fig. 3e）。与LOF方法相反，miR-21a的异位表达显著促进β-tubulin表达并抑制GFAP表达。同时，与对照组相比，miR-21a LOF组中Tuj1⁺细胞比例显著增加，GFAP⁺细胞比例显著下降（Fig. 3g，h）。因此，LOF和GOF的研究都表明miR-21a通过促进神经发生和抑制胶质生成来调控NPCs的分化方向。

Fig. 3 miR-21a调控NPCs的神经胶质形成

4、miR-21a介导EXOs和iEXOs对神经元分化的差异作用

为了确定EXOs和iEXOs对神经元分化的差异效应是否由这两种外泌体之间miR-21a的不同水平引起，作者将miR-21a mimics或对照组转染到NPCs和iNPCs，并在转染48小时后在培养上清中收集外泌体（Fig. 4a）。qPCR结果显示，在NPCs和iNPCs中过表达miR-21a时，外泌体中miR-21a表达水平也会显著提高。随后NPCs分别与相应外泌体，即过表达或不过表达miR-21a在分化条件下共培养7天。免疫荧光分析表明，当miR-21a在EXOs和iEXOs中过表达时，神经元分化得到了显著促进，而胶质细胞的分化则保持不变，这是由Tuj1⁺和GFAP⁺的定量决定的（Fig. 4b，c）。通过qPCR分析证实，与对照组相比，过表达miR-21a的外泌体具有更高的促进神经元分化的能力，这点通过miR-21a过表达组中β-tubulin转录水平的显著增加可以确定（Fig. 4d）。总之，结果表明，miR-21a可以介导EXOs和iEXOs对神经元分化的差异影响。

Fig. 4 miR-21a介导外泌体对神经元分化的影响

结论

本篇研究表明EXO和iEXO可以通过转移关键miRNA来促进神经发生，为NPCs/iNPCs移植的治疗效果提供了一种可能的机制，这揭示了用于治疗神经疾病的高效的无细胞治疗策略的发展。

参考文献：

[1] Ma Y, et al. Exosomes released from neural progenitor cells and induced neural progenitor cells regulate neurogenesis through miR-21a. Cell Commun Signal. 2019 Aug 16;17(1):96.